现代诊断与治疗杂志社

关键词：牙本质 牙髓 矿化

胡 玲,倪世磊,詹骆宁,刘晓莉,谢晓昱,李 毅*

 

(1.吉林大学口腔医院,吉林 长春130021;2.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室,吉林 长春130021)

 

牙髓再生是利用组织工程学原理使种子细胞在支架材料上扩增生长成为类似牙髓的新生组织,恢复正常的牙髓-牙本质复合体的结构和功能。壳聚糖(chitosan,CS)作为组织工程研究中常用的支架材料之一,是一类由几丁质脱乙酰化处理获得的线性阳离子多糖,由于具有合适的机械性能、良好的生物相容性、降解性、广谱抗菌性等众多生物学特性,近年来在组织工程再生领域得到了广泛应用。本文针对壳聚糖的生物学特性,结合其目前在牙髓再生领域的研究进展进行综述。

 

1 壳聚糖的一般特性

1.1 壳聚糖的结构

 

壳聚糖是天然大分子中含量最丰富的多糖之一,存在于节肢动物的外骨骼或真菌和酵母的细胞壁中,是由D-氨基葡萄糖和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖通过β-(1,4)-糖苷键组成的共聚物。分子量和脱乙酰度(degree of deacetylation,DD)对壳聚糖的理化性质及生物学特性起到决定性作用。一般来说,壳聚糖的DD越高,分子链中氨基的质子化程度越高,水溶性及生物学效应越高。壳聚糖的分子量与聚合物链的构型相关,低分子量壳聚糖的聚合物链通常呈松弛、近似线性的链,暴露出较多的氨基;分子量增加主链原子超过600个时,聚合物链开始盘绕,氨基基团被包裹在聚合物内,氨基质子化程度降低,因此低分子量的壳聚糖表现出更强的水溶性和生物活性[1]。

 

1.2 壳聚糖的生物相容性

 

壳聚糖具有良好的生物相容性,可促进多种细胞的增殖,这是壳聚糖在组织再生领域被广泛应用的主要原因之一。壳聚糖对人牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)无明显细胞毒性,将多孔壳聚糖支架与DPSCs 共同培养时DPSCs表现出明显的细胞增殖活性[2]。但这种促进细胞增殖的作用机制在不同细胞中可能存在不同。研究表明,壳聚糖处理的间充质干细胞中,细胞数量及TLR2和TLR4的表达较空白组明显增强,这说明壳聚糖可通过Toll样受体(toll-like receptor,TLR)调节间充质干细胞增殖[3]。而将壳聚糖与角膜上皮细胞(RCECs)共培养的实验则发现壳聚糖处理的RCECs数量和p-ERK1/2表达水平显著提高,使用ERK抑制剂PD98059预处理RCECs则这种改变消失,证明壳聚糖可激活ERK信号通路促进细胞的增殖[4]。

 

1.3 壳聚糖的降解性

 

牙髓重建是一个需要时间的复杂过程,支架的降解对牙髓组织生长和基质沉积产生重要影响。壳聚糖在体内降解所需的主要酶之一是溶菌酶,该酶通过水解乙酰化基团来降解壳聚糖[5]。高DD和低分子量的壳聚糖乙酰基基团较少,降解速率快。研究表明,对壳聚糖进行改性及修饰或可调节壳聚糖的降解速率,Navidi等[5]在壳聚糖支架中添加SAPO-34、CaO和Fe2O3纳米粒子,使溶菌酶作用于乙酰化基团的难度增加,72小时内支架的降解率从23%降低至16%;毕博等[6]用不同浓度的还原氧化石墨烯(rGO)修饰壳聚糖支架,在相同降解时间时,复合支架的降解率随着rGO含量的增加而逐渐下降。牙髓再生需要支架材料在合适的时间内降解,通过对壳聚糖的改性修饰可使支架降解速率与牙髓组织重建时间相适配。

 

1.4 壳聚糖的机械性能

 

机械性能是支架材料的重要性能之一,支架应提供组织起源的刚度,机械强度允许通过外科手术植入。壳聚糖支架机械强度较低,据报道,DD高于60%的壳聚糖的拉伸强度为250～400 g/mm2,未交联壳聚糖支架的弹性模量为3.8 kPa,交联后弹性模量提高到7.4～19.9 kPa[7]。在牙髓再生中,材料弹性模量低易引起支架收缩可能会导致细胞与牙本质壁间的空隙对新组织的形成产生不利影响[8],机械强度高的材料具有优异的机械稳定性,更利于牙髓干细胞分化和牙本质样组织的形成[9]。因此,提高壳聚糖支架的机械性能有利于牙髓组织再生的过程。目前提高壳聚糖支架机械性能的主要方法是将壳聚糖与其他材料复合使用,将10%的生物活性玻璃加入壳聚糖支架,壳聚糖的抗压强度从34 kPa提高到363 kPa,压缩模量从0.41 MPa提高到10.04 MPa[10];而向壳聚糖支架中加入0.5%还原氧化石墨烯后,支架的弹性模量由(1.10±0.14)MPa上升到(1.87±0.25) MPa,同时支架的吸水率提高[6]。

 

2 壳聚糖的抗菌作用

控制根管内感染是牙髓再生的关键之一,确保根管内的无菌环境对牙髓组织再生极其重要[11]。壳聚糖具有广谱抗菌性能,对细菌和真菌均有抑制作用。研究表明,壳聚糖对持续性牙髓感染中常见的粪肠球菌(细菌)和白色念珠菌(真菌)的浮游形态和生物膜均产生抑制效果,可降低培养液中游离微生物数量,抑制生物膜中微生物的代谢活性、延缓生物膜的形成[12-13]。改性的壳聚糖在抗菌方面可能起到更好的作用,Thienngern等[14]将壳聚糖与聚乙二醇或丙二醇共混进行物理改性,增加了壳聚糖的流动性,对牙本质小管的渗透增强从而使壳聚糖更好的与定植到牙本质小管内的微生物作用;将壳聚糖与Ag、Au、Zn、Cu等具有抗菌活性的金属粒子复合改性,对多种革兰阴性菌和革兰阳性菌发挥协同增效抗菌作用[15];Han等[16]对壳聚糖甲基化和磺化修饰得到电离壳聚糖(ICS),增加了壳聚糖氨基上的正电荷密度,能更好地吸附在微生物表面发挥抗菌作用。壳聚糖的阳离子特性增强导致抗菌性增加,说明壳聚糖的抗菌机制可能是通过氨基上的正电荷与细菌表面的负电荷相互作用,导致细胞膜通透性的变化诱导细菌破裂死亡。另一报道指出,绿原酸接枝壳聚糖能降低金黄色葡萄球菌中ATP酶和过氧化氢酶的活性,影响细菌的抗氧化系统和能量代谢;同时破坏细胞壁结构并与遗传物质DNA结合,影响金黄色葡萄球菌的活性,说明壳聚糖的抗菌机制还可能与影响细菌代谢和破坏细菌遗传物质相关[17]。

 

3 壳聚糖诱导干细胞分化作用

牙髓再生主要包括牙本质形成、牙髓血运重建和神经再支配,通过干细胞牙源性分化、血管内皮分化及神经分化可实现不同结构的组织再生。壳聚糖支架具有诱导干细胞分化的能力,细胞在三维支架上沿着多孔结构立体生长,胞体拉伸、细胞骨架发生形变,这种形变产生力学刺激作用于细胞膜上的相关蛋白并传递到细胞内部,激活下游一系列信号通路,如MAPK通路、β-catenin通路等,从而影响细胞分化[18]。

 

3.1 壳聚糖诱导干细胞牙源性分化

 

研究发现,壳聚糖可促进DPSCs成牙分化,Porrelli等[19]将乳糖改性的壳聚糖(CTL)均匀涂覆在支架多孔结构表面研究其对DPSCs成牙分化的作用,发现CTL能促进DPSCs碱性磷酸酶的表达,并使矿物质沉积增加,证明CTL在促进DPSCs牙源性分化中具有一定作用。壳聚糖还可促进脱落乳牙干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHEDs)成牙分化,在Subhi等[20]的实验中发现壳聚糖加入到水门汀内后SHEDs的牙源性分化标志物表达水平较加入前升高并具有统计学意义,证明壳聚糖的加入促进了SHED的成牙本质向分化。体内研究同样证明壳聚糖促进干细胞成牙分化的效果,Ashry等[21]在狗盖髓模型中将壳聚糖与MTA作为盖髓剂,检测到添加壳聚糖的MTA组样品中DSPP的mRNA表达水平较仅使用MTA组显著提高,进而说明壳聚糖促进DPSCs牙源性分化的能力。然而目前壳聚糖促进干细胞成牙本质分化的机制尚不清楚。

 

3.2 壳聚糖诱导干细胞血管内皮分化

 

牙髓活力依赖于血运重建,壳聚糖诱导干细胞向血管内皮细胞分化、促进新血管形成的能力为牙髓血运重建提供理论基础。壳聚糖可促进不同来源的MSCs血管内皮分化。罗鸣骜等[22]为研究壳聚糖对脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)存活与分化的影响,将ADSCs加载到壳聚糖支架注射到小鼠背部皮下,壳聚糖促进了ADSCs血管内皮分化和血管的形成,可能原因是支架提供的良好细胞生长微环境促进了这种分化。另一项实验证明壳聚糖还可以增加人胎盘来源的间充质干细胞血管内皮分化标志物VEGF的表达,实现血管内皮分化[23]。目前,壳聚糖促进干细胞血管内皮分化的机制有待进一步研究。

 

3.3 壳聚糖诱导干细胞神经分化

 

牙髓内神经可感受外界刺激,调节髓内血管的收缩和舒张,维护牙髓的稳态。壳聚糖促进DPSCs神经分化是实现新生牙髓神经再支配的重要途径。据报道,壳聚糖可能通过不同机制促进DPSCs神经分化。Zhang等[24]在探究壳聚糖对DPSCs神经分化的影响时,将壳聚糖支架与DPSCs在体外共同培养,蛋白质印迹分析和PCR检测结果显示壳聚糖组DPSCs的神经细胞特异性标志物CNPase、MAP-2和GFAP的表达较对照组显著增高,证明壳聚糖具有诱导DPSCs神经分化的能力,这种作用可能与壳聚糖激活Wnt/β-catenin信号通路相关。Zheng等[25]在摸索体外DPSCs神经分化的条件时,合成多孔壳聚糖支架接种DPSCs后细胞中神经分化标志物表达比空白组增加,说明壳聚糖可促进DPSCs的神经分化,进一步研究表明壳聚糖诱导DPSCs神经源性可能与ERK信号通路的激活相关。

 

4 壳聚糖的促进矿化作用

牙髓再生的内容之一是牙本质的新生,主要是成牙本质细胞矿物质沉积的过程。壳聚糖具有抑制硬组织脱矿和促进矿化的性能,在微环境中可与H+结合提高溶液pH值,也能通过静电作用吸附到牙齿表面形成保护层达到抑制脱矿的作用[26];壳聚糖含氮量高的特点使其可携带钙和磷酸盐等矿化离子,同时壳聚糖能穿透牙釉质向病变深层输送再矿化离子,促进再矿化过程[27]。Subhi等[20]向硅酸钙基水门汀内添加壳聚糖后与SHEDs共同培养,随着壳聚糖浓度的升高和孵育时间的延长,SHEDs细胞中钙沉积量逐渐增加,证明了壳聚糖促进矿化的能力。Zhang等[28]发现发现CMC在人工龋齿影响牙本质模型中可稳定无定形磷酸钙,促进矿物在牙本质I型胶原蛋白纤维内部沿着胶原纤维长轴定向排列,无CMC组则形成纤维外矿化,说明壳聚糖可诱导牙本质仿生矿化,相较于无序矿化具有更优异的生物学和机械力学性能。另一项研究中发现[29],CMC不仅能够诱导脱矿牙本质仿生矿化,还能提高人工牙本质龋损的粘接性能。

 

5 壳聚支架在牙髓再生领域应用现状

目前的研究表明,能够携带干细胞并输送生长因子的可生物降解的3D植入式或可注射支架是牙髓再生的最合适方法,壳聚糖基复合支架应用于牙髓再生表现出不错的效果。Bordini等[30]将壳聚糖与氢氧化钙和β甘油磷酸盐(βGP)复合制成多孔壳聚糖支架,具有良好的圆形孔隙网络,这种支架促进牙髓细胞增殖,对远处牙髓细胞具有趋化作用,即使在没有成骨培养基补充的情况下也能诱导牙母细胞成牙分化,同时刺激矿化基质沉积,促进牙本质形成。Moreira等[31]去除大鼠第一磨牙根管内侧牙髓建立体内原位牙髓模型,向根管内注射血凝块-壳聚糖水凝胶混合支架并使用5 J/cm2的能量密度进行光生物疗法(PBMT),在4周时观察到根管内发育良好的牙髓样组织,新生结缔组织内含年轻的血管、沿根管壁存在新生牙本质,且根管内未检测到炎症、未见根管内部/外部吸收;其中一个样本甚至观察到一层与牙本质壁紧密接触、胞质延伸穿透牙本质小管的细胞,这层细胞成牙本质细胞标志物HSP-25阳性表达,表明血凝块-壳聚糖水凝胶混合支架在PBMT存在情况下可能形成与天然结构相似的牙髓-牙本质复合体。Ei等[32]将携带自体DPSCs和生长因子的壳聚糖水凝胶支架移植到犬根尖周炎的年轻恒切牙中,根管内出现类似牙髓组织的纤维组织,内含多条大小血管,还出现牙本质样组织,沿着根管壁的牙本质具有牙本质小管样结构,证明携带干细胞并输送生长因子的壳聚糖水凝胶支架在牙髓再生领域具有巨大的潜力。

 

6 展望

壳聚糖作为天然高分子材料,价格低廉、性能优异,不仅可作为支架材料发挥抗菌作用为牙髓再生提供无菌环境,诱导干细胞分化、促进矿化保证牙髓组织工程中不同结构组织的形成,同时也可单独或与其他材料复合作为物质载体携带生物活性分子,协同促进牙髓组织再生。然而,目前关于壳聚糖促进牙髓再生的研究尚有不足：(1)壳聚糖基材料促进形成的新生牙髓的组织学结构及生物学功能未与天然牙髓进行对比,无法得知再生的牙髓样组织与天然牙髓的差异;(2)目前研究停留在实验室水平,临床疗效尚未可知;(3)壳聚糖在牙髓再生中发挥作用的机制仍需进一步研究。